میکروسکوپی فاز کنتراست یک روش اپتیکی برای تقویت کنتراست تصویر است که به طور ویژه برای تصویرنگاری نمونههای شفاف مانند سلولهای زنده، ذرات زیرسلولی، میکروارگانیسمها، الگوهای لیتوگرافی، قطعات شیشه و غیره مورد استفاده قرار میگیرد. در این روش که برای اولین بار در سال 1934 توسط فیزیکدان هلندی Frits Zernike توصیف شد، از یک مکانیزم اپتیکی برای تبدیل تغییرات فاز نور به تغییرات در دامنه نور استفاده میشود، که در نهایت میتواند به عنوان بهبود کنتراست تصویر تجسم یابد. یکی از مهمترین مزایای میکروسکوپ فاز کنتراست به طور ویژه در کاربردهای بیولوژی، در این است که سلولهای زنده را می توان در حالت طبیعی خود بررسی کرد بدون اینکه قبلاً کشته، ثابت و رنگآمیزی شده باشند. در نتیجه، دینامیک فرآیندهای بیولوژیکی را میتوان با جزئیات و به طور دقیق مشاهده و ثبت کرد. با توجه به اهمیت و کاربردهای بسیار زیاد این روش میکروسکوپی، در این مقاله به بررسی سیستم اپتیکی و نحوه عملکرد یک میکروسکوپ فاز کنتراست میپردازیم.
عملکرد اپتیکی
همانطور که در مبحث معیارهای کیفیت عملکرد میکروسکوپ نوری گفته شد، متداولترین تکنیک مورد استفاده در میکروسکوپی نوری، روش میدانروشن (brightfield) است که به طور ویژه برای نمونههای رنگآمیزی شده (stained) و یا انواع نمونههایی که جذب طبیعی زیاد در ناحیه نور مرئی دارند، استفاده میشود. در هنگام عبور/بازتاب نور از این نمونهها، دامنه یا شدت جبهه موج فرودی کاهش مییابد (جذب میشود) و این تغییرات دامنه نور نهایتا به عنوان کنتراست تصویر ثبت میشود. نمونههایی که در چنین سیستمی و با روشنایی (نور) زیاد تصویر میشوند، به عنوان اشیاء دامنهای (amplitude objects) شناخته میشوند. اما برای نمونههای شفاف با جذب نور کم، که تغییرات دامنه نور عبوری از آنها محسوس نیست، نیاز است از روشهای جایگزین برای بهبود کنتراست تصویر استفاده شود. با افزودن تعدادی قطعات اپتیکی جانبی به یک میکروسکوپ استاندارد میدانروشن، میتوان از روش فاز کنتراست به عنوان یک روش تقویتکننده کنتراست، استفاده نمود. در این روش پراش امواج نوری توسط نمونهها مورد مطالعه قرار میگیرد و تغییرات فاز نور در اثر پراش، به اختلاف دامنه تبدیل شده که در تصویر خروجی قابل مشاهده خواهد بود. نمونههای شفاف که در اینجا اصطلاحاً به آنها اشیاء فازی (phase objects) گفته میشود، به دلیل پدیدههای پراش و پراکندگی که در بیشتر لبههای این اجسام رخ میدهد، با اپتیک فاز کنتراست به راحتی قابل مشاهده هستند.
برهمکنش نور و نمونه فازی
روزنه حلقهای (Annulus) و صفحه فاز (Phase Plate)، دو قطعه اپتیکی اصلی در سیستم میکروسکوپی فاز کنتراست هستند که مسئول تبدیل تغییرات فاز به تغییرات دامنهای که توسط چشم انسان قابل مشاهده باشد به حساب میآیند. در تصویر مقابل شماتیک یک میکروسکوپ فاز کنتراست به همراه چیدمان قطعات اپتیکی آن مشاهده میشود. در این سیستم، نور لامپ از طریق یک لنز جمع کننده بر روی صفحهای شامل یک روزنه حلقهای هدایت میشود. این صفحه در زیر استیج و کندانسور قرار دارد. جبهههای موج از روزنه حلقهای با فاز و زاویه فضایی مشخصی خارج میشوند، سپس نمونه را روشن کرده و یا بدون تغییر از نمونه عبور می کنند و یا توسط ساختار و لبههای نمونه پراشیده شده و دچار جابجایی فاز میشوند. بنابراین جبهه موج فرودی با عبور از نمونه به دو جز تقسیم میشود. مولفه اصلی یک جبهه موج مسطح پراش نیافته (پراش مرتبه صفر) است که معمولاً به آن موج فراگیر (Surround) یا موج S میگویند، که از داخل و اطراف نمونه عبور میکند اما با آن تعامل ندارد. علاوه بر این، بخشی از موج توسط نمونه در جهات مختلف، در یک زاویه فضایی بزرگ، پراکنده شده که به عنوان موج پراشیده (Diffracted) یا موج D شناخته میشود. پس از خروج از صفحه نمونه، امواج نوری فراگیر و پراشیده از طریق تداخل با یکدیگر ترکیب شده و یک موج ثانویه به نام موج ذره (Particle) را تولید میکنند که به آن موج P می گویند. رابطه ریاضی بین پرتوهای مختلف تولید شده در میکروسکوپ فاز کنتراست را می توان به سادگی به صورت زیر توصیف کرد:
P = S + D
این امواج وارد لنز جلویی شیئی شده و متعاقباً در صفحه تصویر میانی کانونی میشوند. در نهایت تشکیل تصویر نمونه براساس اصل تداخل امواج و با تبدیل تغییرات فاز به تغییرات دامنه ایجاد میشود. اگر دامنه امواج P و S در صفحه تصویر میانی به طور قابل توجهی متفاوت باشد، تصویر نمونه مقدار قابل توجهی کنتراست به دست میآورد و به راحتی در میکروسکوپ قابل مشاهده است. در غیر این صورت، نمونه شفاف باقی مانده و تصویر مناسبی تشکیل نمیشود.
برای بهبود کیفیت تصویر و اثرات تداخلی، قبل از تشکیل تصویر، این پرتوها از یک صفحه فاز (Phase plate) عبور داده میشوند. صفحه فاز قبل از صفحه تصویر میانی و در صفحه کانونی عقبی شیئی (rear Focal plane)، قرار داده شده و دامنه جبهه موجهای S (و در نتیجه P) را تغییر داده و فاز مربوط به پرتو S را نیز جابجا میکند. روابط فاز بین امواج S ، D و P در صفحه کانون عقبی شیئی و همچنین در صفحه تصویر میانی، در شکل زیر سمت چپ، نشان داده شده است. همانطور که گفته شد، امواج پراش نیافته S و پراشیده D که به ترتیب با خطوط قرمز و آبی نشان داده شدهاند، از طریق تداخل با یکدیگر ترکیب میشوند تا موج ذره P را تولید کنند که به صورت موج سبز رنگ در تصویر دیده میشود. موج پراشیده D نسبت به موج S از دامنه کمتری برخوردار است، زیرا اغلب تعداد فوتونهای پراشیده کمتر از فوتونهای فراگیر هستند. اما امواج P که دامنه نسبی آنها نسبت به امواج S میزان کنتراست نمونه را تعیین می کند، بسته به نوع تداخل S و D میتواند متغیر باشد. پس از اعمال تغییرات اپتیکی بر روی پرتوها در صفحه کانون عقبی شیئی، در نهایت امواج در صفحه تصویر میانی، کانونی میشوند تا تصویر نهایی در چشمی/دوربین میکروسکوپ مشاهده شود. نکته قابل توجه در اینجا این است که موج تولید شده توسط پراش از نمونه یعنی موج D، هرگز مستقیماً مشاهده نمی شود، بلکه امواج S و موج تداخلی ثانویه P نهایتا در تصویر مشاهده میشوند. کیفیت تصویر در این روش، به اختلاف شدت نسبی و یا به عبارتی به دامنه امواج P و S بستگی دارد.
فاز کنتراست مثبت و منفی
میدانیم که صفحه فاز، به منظور اصلاح فاز و دامنه جبهه موجهای S و P و جداسازی فضایی آنها از هم استفاده میشود. در سیستمهای فاز کنتراست مثبت، فاز جبهه موج خطی S نسبت به جبهه موج کروی D با گذر از صفحه فاز به اندازه 90 درجه جلو برده میشود. در این حالت این دو پرتو در اختلاف فاز بیشینه قرار میگیرند تا تداخل مخرب بین آنها، موج P با کمترین دامنه را ایجاد کند. حال اختلاف بین دامنه امواج S و P زیاد شده و نهایتا سبب افزایش کنتراست تصویر میشود. در سیستم فاز کنتراست منفی، فاز جبهه موج S نسبت به D در عبور از صفحه فاز به اندازه 90 درجه عقب میافتد. در این حالت، اختلاف فاز بین پرتو S و D کمینه شده و تداخل سازنده بین آنها، موج P با بیشترین دامنه را ایجاد کند. در این حالت نیز اختلاف بین دامنه امواج S و P زیاد شده و سبب افزایش کنتراست تصویر میشود. از آنجا که چشم انسان تفاوت در شدت را به عنوان کنتراست تفسیر می کند، نمونه مورد بررسی اکنون در چشمیهای میکروسکوپ به خوبی قابل مشاهده است و همچنین با استفاده از یک دوربین دیجیتالی، تصویری با کنتراست بهبود یافته را میتوان ثبت کرد. در سیستمهای فاز کنتراست مثبت چون دامنه موج P کمتر از موج S است، باعث می شود که نمونه نسبتاً تیرهتر از پسزمینه به نظر برسد، همانطور که در شکل بالا سمت راست، در تصویری با برچسب POS نشان داده شده است. اما در سیستم فاز کنتراست منفی چون دامنه موج P بیشتر از موج S است کاملا برعکس بوده و نمونه در برابر پسزمینه خاکستری تیره، روشن به نظر می رسد. تصویر سیستم فاز کنتراست منفی در شکل مذکور با برچسب NEG دیده میشود.
کندانسور حلقهای
امروزه در میکروسکوپهای فاز کنتراست ، کندانسورهای ویژهای که شامل روزنه حلقهای هستند و همچنین شیئیهای خاصی که در برگیرنده صفحه فاز هستند، استفاده میشوند. در تصویر مقابل یک کندانسور حلقهای (Condenser Annulus) مخصوص میکروسکوپی فاز کنتراست را مشاهده میکنید. در این قطعه، صفحهای شامل چندین فیلتر با روزنه حلقهای که در ابعاد مختلف و قابل انتخاب هستند، در زیر دیافراگم کندانسور دیده میشود. این فیلترها به صورت یک صفحه تخت سیاه مات (جاذب نور) با یک شفاف حلقهای با قطر و ضخامت متفاوت ساخته میشوند و میتوانند پرتو نوری را در فاز مشخص و همچنین در زاویه فضایی متفاوت از نمونه عبور دهند.
شیئی فاز کنتراست
همانطور که پیشتر گفته شد از ضروریات میکروسکوپی فاز کنتراست، وجود یک صفحه فاز به منظور جداسازی فضایی امواج و تغییر فاز و دامنه نور عبوری از شیئی است. امروزه در طراحی شیئیهای مخصوص میکروسکوپی فاز کنتراست، این صفحه فاز در محل کانون عقبی شیئی تعبیه شده است. صفحه فاز داخلی، همانطور که در تصویر مقابل مشاهده میشود، به صورت یک حلقه نازک از یک فیلم فلزی نیمه جاذب است که بر روی اجزای داخلی شیئی پوشانده میشود و دارای سطوح مختلف جذب و جابجایی فاز است. این حلقه به صورت طرح مزدوج (Conjugate) حلقه موجود در کندانسور تعبیه میشود. به عبارتی بخشی از صفحه فازی که حلقه کندانسور بر روی آن متمرکز شده است، منطقه مزدوج نامیده می شود، در حالی که مناطق باقی مانده به عنوان منطقه مکمل شناخته میشوند. به طور کلی، ناحیه مزدوج در صفحه فاز، گستردهتر است از ناحیهای که توسط تصویر حلقه کندانسور تعریف شده (حدود 25 درصد بزرگتر) تا میزان نور پرتو S در ناحیه مکمل را به حداقل برساند. ناحیه مزدوج حاوی ماده مورد نیاز برای تغییر فاز پرتو S به اندازه ربع طول موج است و همچنین میتواند دامنه پرتو S را تا 60-90 درصد کاهش دهد. در تصویر مقابل حلقههای متداول در یک کندانسور حلقهای و همچنین صفحات فاز داخلی شیئیهای مخصوص فاز کنتراست مشاهده میشود.
نکتهای که باید در مورد میکروسکوپی فاز کنتراست بخاطر بسپاریم این است که هر شیئی مخصوص فاز کنتراست طوری طراحی میشود که شامل صفحه فاز باشد، این ویژگی در سایر شیئیهای میکروسکوپی وجود ندارد. شیئیهای فاز کنتراست مدرن، که توسط شرکتهای مختلف طراحی و تولید شده و در قیمتهای نسبتا بالایی عرضه میشوند، قابلیت استفاده در ترکیب با تکنیکهای کمکی تقویت کننده کنتراست، مانند میدان تاریک، کنتراست تداخل دیفرانسیل (differential interference contrast)، فلورسانس و پولاریزان را نیز دارا میباشند. مانند تصویر مقابل، اگر به داخل شیئی از بالا نگاه کنید، حلقه تیره بر روی عدسی داخل شیئی قابل تشخیص است.
