تکنیک پراکندگی دینامیکی نور (DLS) در آنالیز ذرات

در تصویر مقابل یک چیدمان معمول از دستگاه DLS را مشاهده می‌کنید. موقعیت آشکارساز بسته به مدل و شرکت تولیدکننده متفاوت است و می‌تواند در زوایای مختلف ازجمله در 173⁰ یا 90⁰ قرار داشته باشد. برای نمونه‌های مرسوم کلوئیدی، معمولاً اندازه‌گیری در زاویه پراکندگی 90 درجه انجام می‌شود. برای نانوذرات، پروتئین‌، آنتی‌بادی، پپتاید و دیگر نمونه‌هایی با سایز کمتر از 50 نانومتر، اندازه‌گیری‌ها در زاویه پراکندگی عقب (backscattering angle) یعنی در حدود 180⁰-173⁰ درجه انجام می‌شود که بهترین سیگنال به نویز و تکرارپذیری را امکان پذیر می‌کند.

یک دستگاه DLS به طور کلی توانایی اندازه‌گیری سه مشخصه از ذرات یا ملکول‌ها را دارد. این سه پارامتر بنیادی عبارتند از :اندازه ذره  (Particle size)، پتانسیل زتا  (Zeta potential) و وزن ملکولی (Molecular weight).

تعیین اندازه ذره

هر ذره موجود در یک محلول، دائماً در حال حرکت است و حرکتش به ذرات دیگر مرتبط نیست. حرکت ذرات در یک سیال، حرکت براونی نامیده می‌شود که یک حرکت تصادفی است و در اثر بمباران ذرات توسط مولکول‌های حلالی که آنها را احاطه کرده‌اند ایجاد می‌شود. هرچه ذره بزرگتر باشد، حرکت براونی کندتر خواهد بود. ذرات کوچکتر توسط مولکول‌های حلال بیشتر “لگد” می‌شوند و با سرعت بیشتری حرکت می‌کنند. در روش DLS هنگامی که پرتو نور لیزر به ذرات متحرک برخورد کند، به  دلیل حرکت براونی ذرات، پرتو نوری با فرکانس متفاوت پراکنده شده و در فاز نور پراکنده نوسان ایجاد می‌شود. میزان تغییر در فرکانس و فاز نور پخش شده به سرعت براونی ذرات وابسته است. سرعت براونی نیز با اندازه ذرات ارتباط دارد و در نهایت برای تعیین اندازهٔ ذرات مورد استفاده قرار می‌گیرد. سرعت حرکت براونی با خاصیتی با عنوان ضریب انتشار انتقالی (translational diffusion coefficient) که معمولاً با نماد D مشخص می‌شود، طبق رابطه ?=B/?2 بدست می‌آید. کمیت q با عنوان طول بردار پراکندگی شناخته شده و طبق رابطه زیر به طول موج نور، زاویه پراکندگی و ضریب شکست محلول (معمولا با ضریب شکست حلال خالص جایگزین می‌شود) وابسته است.

q=(4πn/λ) sin⁡ (θ/2)

کمیت B نیز مقداری ثابت است که نحوه محاسبه آن در ادامه خواهد آمد. در نهایت اندازه یک ذره با استفاده از معادله استوکس-اینشتین به صورت زیر محاسبه می‌شود:

d(H)=kT/3πηD

در این رابطه D ضریب انتشار انتقالی، K ثابت بولتزمن، T دمای مطلق، η ویسکوزیته و d(H) قطر هیدرودینامیکی هستند. قطری که در DLS اندازه گیری می‌شود، مقداری است که به نحوه انتشار ذره (diffusion) در سیال اشاره می‌کند و به همین دلیل قطر هیدرودینامیکی نامیده می‌شود. در واقع سایز ذره، قطر یک کره فرضی است که ضریب نفوذ انتقالی مشابه با ذره مورد نظر دارد. باید به خاطر داشت که قطر هیدرودینامیکی یک اندازه‌گیری تقریبی از سایز ذرات است و تقریبا هیچ اطلاعاتی از شکل ذره ندارد؛ که آیا واقعا کروی است، بیضوی است و یا شکلی کاملا متفاوت.

نوسانات در شدت نور

در پراکندگی نور پویا (DLS)، ضریب انتشار انتقالی یا به عبارتی سرعتی که در آن ذرات در حال انتشار هستند، با اندازه‌گیری نرخی که شدت پراکندگی نوسان می‌کند، محقق می‌شود (تعیین ضریب B). این نوسانات در شدت نور پراکنده چگونه بوجود می‌آید؟

تصور کنید اگر یک کووت حاوی ذراتی ساکن، با لیزر روشن شود و از یک صفحه نمایش شیشه‌ای برای مشاهده نور پراکنده شده استفاده شود، نمونه با یک طرح کلاسیک اسپکل (Speckle pattern) دیده می‌شود (شکل مقابل). این الگوی اسپکل، در سایز و موقعیت، ساکن خواهد بود به دلیل اینکه کل سیستم ساکن است. فضاهای تاریک در این طرح جایی است که فاز پرتوهای نور پراکنده شده از ذرات، همدیگر را خنثی می‌کنند و دچار تداخل مخرب می‌شوند و حباب‌های روشن در الگوی اسپکل نیز حاصل تداخل سازنده پرتوهایی است که از ذرات می‌آیند و فاز یکسان دارند. برای سیستم ذراتی در حال حرکت براونی، الگوی اسپکل به گونه‌ای دیده می‌شود که به نظر در حال حرکت ثابت است. دلیل این امر تغییر فاز مداوم نور پراکنده شده از ذرات متحرک و شکل‌گیری الگوهای جدید است. در روش دینامیکی اگر ملکول‌ها به اندازه نصف طول موج نور، مکان نسبی‌شان را تغییر دهند،  شدت نور پراکنده شده تغییرات قابل توجهی خواهد کرد. حرکات شدید ذرات کوچک باعث می‌شود که شدت تغییرات نور سریعتر از نور پراکنده از ذرات بزرگ در نوسان باشد.

اگرچه امکان اندازه گیری مستقیم طیف فرکانس‌های موجود در نوسانات نور ناشی ازحرکت براونی ذرات وجود دارد، اما انجام این کار کارآمد نیست و بهترین راه تجزیه و تحلیل نوسانات فاز نور با مشاهده اثرات تداخلی است و برای این منظور از دستگاهی به نام خود همبستگی دیجیتال (digital autocorrelator) استفاده می‌شود. یک دستگاه همبستگی (correlator) اساساً یک مقایسه کننده سیگنال است. این دستگاه برای اندازه گیری میزان شباهت بین دو سیگنال یا یک سیگنال با خود در فواصل زمانی مختلف طراحی شده است. اگر شدت یک سیگنال در یک مقطع زمانی خاص و در زمانی بسیار بعدتر، با خود مقایسه شود، برای سیگنالی با نوسانات تصادفی، بدیهی است که شدتها به هیچ وجه مرتبط نخواهند بود. به عبارتی، آگاهی از شدت سیگنال اولیه اجازه نمی‌دهد شدت سیگنال در زمان بی‌نهایت پیش‌بینی شود. این امر در مورد هر فرآیند تصادفی مانند انتشار (diffusion) صادق خواهد بود. با این حال، اگر سیگنال ناشی از یک فرایند تصادفی مانند حرکت براونی، در زمان t با سیگنال در t+2τ مقایسه شود، همچنان یک همبستگی منطقی بین دو سیگنال وجود خواهد داشت، اما به خوبی همبستگی دوسیگنال در زمان t و t+τ نیست. در نتیجه می‌توان گفت که خودهمبستگی با گذشت زمان کاهش می‌یابد. در آنالیز DLS نوسانات زمانی شدت معمولاً با استفاده از تابع خودهمبستگی فوتون‌ها (Auto Correlator Function) و طبق رابطه زیر اندازه‌گیری می‌شوند که G(t) تابع همبستگی و I(t) شدت پراکنده را نشان می‌دهد.

G(τ)=〈I(t).I(t+τ)〉

زمان مورد محاسبه τ در روش DLS معمولاً بسیار کوچک است، و زمان نمونه همبستگی (sample time of the correlator) نامیده می‌شود. زمان نمونه همبستگی τ معمولا چند نانوثانیه و یا میکروثانیه انتخاب می‌شود و ∞=τ نیز می‌تواند به ترتیب میلی‌ثانیه یا دهها میلی‌ثانیه باشد. خودهمبستگی کامل در زمان صفر با عدد واحد (1.00) و عدم خودهمبستگی در ∞=τ با عدد صفر (0.00) نشان داده می‌شود.

به دست آوردن اطلاعات سایز از تابع همبستگی

اندازه ذرات با استفاده از الگوریتم‌های مختلفی از تابع همبستگی بدست می‌آید. دو رویکرد وجود دارد که می‌توان از آنها استفاده کرد: (1) برازش کردن تابع نمایی تکی (single exponential) به تابع همبستگی برای بدست آوردن اندازه متوسط (قطر متوسط) و برآورد عرض توزیع (شاخص بس‌پراکندگی) که به معنای آنالیز تجمعی شناخته می‌شود) و یا (2) بزارش کردن تابع نمایی چندگانه به تابع همبستگی برای بدست آوردن توزیع اندازه ذرات (مانند حداقل مربعات غیر منفی (NNLS) یا CONTIN) که حالت کلی تری برای محاسبه بس پراکندگی است. مانند رابطه زیر، هر تابع نمایی با ضریب B مشخص می‌شود که برای هر تابع متفاوت است. این ضریب همان پارامتر مورد نیاز برای محاسبه ضریب ضریب انتشار انتقالی D است که بیشتر اشاره شد. توزیع سایز بدست آمده از رابطه استوکس-انیشتین، معادل نمودار شدت نسبی نور است که توسط ذرات در اندازه‌های مختلف پراکنده شده است و بنابراین به عنوان توزیع اندازه شدت (intensity size distribution) شناخته می‌شود.

پتانسیل زتا

درک ارتباط میان اندازه ذرات و پتانسیل بین‌آن‌ها، به پتانسیل جریان سیال زتا منجر می‌شود. این پتانسیل نشان‌دهنده میزان مقاومت الکترواستاتیکی بین ذرات است. یکی از آزمون‌هایی که معمولا با دستگاه DLS قابل اجراست، تعیین پتانسیل زتای ذرات است. پتانسیل زتا در اغلب موارد به عنوان شاخصی برای بررسی پایداری پراکندگی نمونه به کار می‌رود. اگر پتانسیل زتا بالا باشد به این معناست که سوسپانسون از نظر پایداری الکتروستاتیکی در وضعیت مطلوبی است. این پارامتر به عنوان تابعی از pH و عاملی در تغییر شیمیایی نمونه، برای ایجاد فرمولاسیون‌های جدید و موادی با پایداری بیشتر به کار می‌رود. مشخص کردن نقطه‌ای که پتانسیل زتا در آن صفر است (نقطه ایزوالکتریک)، شرایط بهینه را برای جداسازی ذرات و یا در نقطه مقابل، ایجاد لخته فراهم می‌کند. اندازه‌گیری پتانسیل زتا در دستگاه‌های DLS مختلف توسط یکی از روش‌های زیر انجام می‌شود.

• روش پراکندگی نور الکتروفورتیک

مرسوم‌ترین روش پراکندگی نور الکتروفورتیک (Electrophoretic Light Scattering (ELS)) روش الکتروفورز داپلر لیزری (Laser Doppler Velocimetry (LDV)) است، که در آن حرکت ذرات باردار در حضور میدان الکتریکی اعمال شده تغییر می‌کند. بزرگی این تغییر داپلر به بار سطحی ذرات مربوط می‌شود. این روش می تواند برای توصیف ذرات کلوئیدی و سایر نانومواد باردار استفاده شود. اندازه‌گیری بالقوه زتا همیشه با استفاده از زاویه پراکندگی 15 درجه، زاویه مناسب برای به حداقل رساندن پهن شدگی انتشار (diffusion broadening)، انجام می‌شود. اما این زاویه پراکندگی رو به جلو نیز می‌تواند برای تشخیص وجود حتی مقادیر کمی از مواد تجمع یافته، به دلیل حساسیت زیاد به ذرات بزرگ، استفاده شود.

• تحلیل فاز پراکندگی نور

روش تحلیل فاز پراکندگی Phase Analysis Light Scattering (PALS) یک زیر مجموعه از روش پراکندگی نور الکتروفورتیک است. بر خلاف ELS ، روش PALS نیازی به استفاده از میدان‌های الکتریکی بزرگ ندارد و احتمال مشکلات حرارتی و یا تغییر رنگ نمونه در اثر میدان بزرگ را کاهش می‌دهد. از آنجا که در روش PALS فقط نیاز است که ذرات به اندازه کسری از قطر خود حرکت کنند تا نتایج خوبی به دست آید، در غلظت‌های تا 3 مولار و با میدان‌های الکتریکی کوچک 1 یا 2 V/cm، حرکت کافی برای به دست آوردن نتایج عالی ایجاد می‌شود. علاوه بر این، ویژگی Autotrack مشکل حرکت همرفت حرارتی را جبران می‌کند و می‌تواند برای نمونه‌های با تحرک بسیار کم و سطح بار کم استفاده شود. این روش به طور معمول برای نمونه‌هایی با پتانسیل زتای کم یا تحرک در روغن‌ها، حلال‌های آلی و مایعات با رسانایی بالا مناسب است.

معایب روش DLS

اگرچه DLS یک روش بسیار مفید است که در بالا مورد بحث قرار گرفت، اما دارای معایب زیر است:

• اندازه گیری DLS به دما و گرانروی حلال بسیار حساس است. بنابراین، دما باید ثابت نگه داشته شود و ویسکوزیته حلال باید برای آزمایش DLS شناخته شود.

• روش DLSیک روش با وضوح نسبتا پایین است که اغلب نمی‌تواند مولکول‌های نزدیک به هم (مانند مونومر و دیمر) را از هم جدا کند.

• اگرچه امکان اندازه‌گیری وزن مولکولی با استفاده از DLS وجود دارد اما این روش چندان قابل اعتماد و قابل‌تکراری نیست. در چنین مواردی، بهتر است از روش‌های جایگزین مانند پراکندگی نور استاتیک یا اولتراسانتریفیوژ تحلیلی (ultracentrifuge) استفاده کرد.

• از آنجا که شدت پراکندگی به مرتبه ششم اندازه ماکرومولکولها بستگی دارد (شدت متناسب با d⁶ که d قطر ماکرومولکول است)، دانه‌های بزرگ (large aggregates) حتی در مقدار بسیار کم نیز بر اندازه‌گیری‌ها تأثیر می‌گذارد. بنابراین، کووت نگهدارنده نمونه باید کاملاً تمیز شود و نمونه باید قبل از اندازه گیری DLS فیلتر شود.

• سیگنال DLS بستگی به اندازه و غلظت ماکرومولکول‌ها دارد. بنابراین، برای به دست آوردن اندازه‌گیری‌های مطمئن، بهینه سازی محدوده غلظت معمولا مورد نیاز است.

• روش DLS محدود به آماده سازی نمونه شفاف است.

نانوتکنولوژی و کاربردهای آن در زمینه‌های مختلف، چالش‌هایی را در درک و تشخیص رفتار مواد در مقیاس نانو ایجاد کرده است. در عصر حاضر بررسی نانوذرات و مشخصات آنها در علم و فناوری نانو به بحث روز تبدیل شده و در جهان به سرعت در حال پیشرفت است. یکی از روش‌هایی که با بهره گیری از آن می‌توان در زمینه تعیین سایز و توزیع اندازه ذرات در ابعاد نانو اطلاعات به دست آورد، روش پراکندگی نور پویا است که به اختصار به آن DLS  گفته می‌شود. اساس عملکرد آنالیز DLS ، حرکت براونی ذرات معلق در فاز مایع است. بنابراین نمونه‌هایی که با این تکنیک مورد آزمون قرار می‌گیرند، لازم است به صورت سوسپانسیون یا امولسیون باشند. دستگاه‌های متنوعی توسط شرکت‌های معتبر دنیا برای اندازه گیری و اجرای این آزمون ساخته و تجاری سازی شده است.