پیشتر و در یک پست آموزشی ارائه شده در وبسایت لبینت، با میکروسکوپ نوری و اجزای سازنده آن آشنا شدیم. برای استفاده از میکروسکوپ‌های نوری ضروری است که با برخی مفاهیم اساسی در مورد کیفیت عملکرد میکروسکوپ آشنایی داشته باشیم. این مفاهیم چندین معیار طلایی در مورد نحوه انتخاب سیستم میکروسکوپی مناسب برای کاربرد مورد نظر، در اختیار ما قرار می‌دهد. در این مقاله قصد داریم به بررسی این معیارها بپردازیم، با ما همراه باشید.
بزرگنمایی
کارکرد اصلی یک سیستم میکروسکوپی، بزرگنمایی تصویر اجسام است. بزرگنمایی، طبق یک تعریف فنی، نسبت اندازه زاویه‌ای‌ظاهری تصویر به اندازه زاویه‌ای واقعی شی است درحالیکه در فاصله 25 سانتی‌متر از چشم انسان قرار داشته باشد. نقش بزرگنمایی تصویر در سیستم میکروسکوپی را عدسی شیئی و چشمی برعهده دارند که طبق معادله زیر بزرگنمایی کلی سیستم میکروسکوپی قابل محاسبه است. در این رابطه MObjective بزرگنمایی شیئی و MEyepiece بزرگنمایی چشمی را بیان میکند.
MSystem=MObjective × MEyepiece
قدرت بزرگنمایی شیئی و چشمی به صورت ضریبی از x بیان میشود. برای مثال یک عدسی شیئی 100x دارای بزرگنمایی 10 برابر بیشتر نسبت به یک عدسی شیئی 10x است. اگر از یک شیئی 100x و چشمی 10x در یک سیستم میکروسکوپی استفاده شود، قدرت بزرگنمایی تصویر نسبت به جسم در حد 1000 برابر خواهد بود. بنابراین انتخاب شیئی و چشمی‌هایی با M بزرگتر به کارکرد بهتر میکروسکوپی، از لحاظ بزرگنمایی، منجر خواهد شد. در ادامه این مبحث خواهیم دید که در انتخاب شیئی برای سیستم میکروسکوپی باید پارامترهای دیگری نیز مد نظر قرار گرفته شود تا عملکرد میکروسکوپ در حالت بهینه و مناسب باشد.
رزولوشن
می‌توان گفت که مهمترین سوال در مورد خوب (مناسب) بودن یک سیستم میکروسکوپی این است که رزولوشن سیستم چقدر است. زولوشن یا وضوح (Resolution)، معیاری از سیستم میکروسکوپی است که بیانگر میزان توانایی سیستم در بازتولید جزئیات جسم در تصویر بدست آمده است. به عبارتی توانایی تمایز بین دو جسم کوچک و بسیار نزدیک به یکدیگر، توسط وضوح سیستم تعیین میشود و هرچه جزئیات جسم کوچکتر باشد، وضوح بالاتری مورد نیاز است. رزولوشن سیستم میکروسکوپی تحت تأثیر عواملی مانند طراحی نوردهی نمونه، قابلیت‌های ادوات اپتیکی و مشخصات سنسور دوربین تعیین میشود.
رزولوشن وابسته به ادوات اپتیکی
در حالت کلی، دو فاکتور وجود دارد که هنگام تصویرنگاری از طریق ادوات اپتیکی، تولید مجدد یک جسم در تصویر که تابع انتقال اپتیکی یا OTF نامیده میشود، را محدود میکند: پراش و ابیراهی. در هر زمان که نور از دیافراگم عبور کند، بسته به طول‌موج نور دچار پراش شده و باعث کاهش رزولوشن میشود. برای مثال، تصویر یک ملکول فلورسنت توسط میکروسکوپ، یک لکه نوری است؛ به بیان فنی‌تر، یک قرص ایری (Airy disk) است که مانند تصویر سمت چپ شکل زیر به نظر می‌رسد.
این لکه نوری در ابعادی بزرگتر از ابعاد ملکول و به دلیل اثرات پراش اتفاق می‌افتد. حال اگر دو ملکول (دو جسم) از وضوح سیستم تصویرنگاری به یکدیگر نزدیکتر باشند، در تصویر تار بوده و لکه‌های تصویر آن دو از هم تمیز داده نمی‌شوند، مانند تصویر وسط، و نمی‌توان گفت که دو جسمِ مجزا هستند ( البته تصویر ترکیب دو جسم در کنار هم ممکن است دو برابر یک جسم، روشنایی داشته باشد، اما هنوز هم نمی‌توان تمایزی بین دو جسم قائل شد).
ابیراهی‌ها نیز خطاهایی هستند که در هر عدسی که در کل سیستم میکروسکوپی موجود است، وجود دارند که بسته به نوع ابیراهی، اطلاعات را تار یا بدجا می‌کنند و در نهایت رزولوشن تصویر را کاهش می‌دهند. بنابراین در حالت کلی می‌توان گفت که رزولوشن مربوط به ادوات اپتیکی در یک سیستم میکروسکوپی، به عدسی شیئی (ابیراهی) و طول موج نور (پراش)، وابسته است و با رابطه آبه (Abbe formula) به صورت زیر تعریف میشود که dA کمترین فاصله مورد نیاز بین دو جسم بسیار کوچک است که سبب میشود در تصویر مجزا از هم دیده شوند.
dAbbe=λ /2NA
در این رابطه NA روزنه عددی (Numerical Aperture) عدسی شیئی است و λ طول موج نور است. چشم انسان به ناحیه طول‌موجی بین 400 تا 700 نانومتر پاسخ می‌دهد، که بازه طیف‌نور مرئی است که برای اکثر مشاهدات میکروسکوپی نوری استفاده میشود. به طور کلی عدسی‌های شیئی با بزرگنمایی بیشتر، مقدار NA بالاتری داشته و در نهایت وضوح بهتری ایجاد می‌کنند. برای مثال یک عدسی شیئی 40x با روزنه عددی 0/3 دارای وضوحی حدود 0/8 میکرون است. بنابراین برای افزایش رزولوشن تصویر، بهتر است که از شیئی‌هایی با بزرگنمایی بیشتر استفاده شود. بهترین حالت وضوح برای یک میکروسکوپ نوری (در طول‌موج مرئی) حدود 0/2 میکرون = 200 نانومتر است. بدین معنی که دو جسمی که با یکدیگر فاصله‌ای کمتر از 200 نانومتر داشته باشند، در تصویر ایجاد شده توسط میکوسکوپ نوری، از هم قابل تمایز نیستند. این مقدار (200 نانومتر) به عنوان حدپراش در تصویرنگاری‌های اپتیکی شناخته میشود.
در مبحث ارائه شده تحت عنوان بررسی مشخصات فنی عدسی‌شیئی، توضیحات جامع‌تری در مورد رزولوشن شیئی‌ها و همچنین در مقاله بررسی مشخصات فنی دوربین‌های تحقیقاتی، توضیحاتی در مورد رزولوشن وابسته به سنسور دوربین تصویرنگاری، بیان شده است.
کانتراست
در کنار مفهوم رزولوشن که بیانگر کوچک‌ترین جزییات قابل تشخیص در تصویر حاصل از میکروسکوپ است، مفهوم کنتراست تفاوت بین روشنایی جزئیات مختلف در تصویر و همچنین در مقایسه با روشنایی پس‌زمینه را بیان میکند. یکی از معیارهای اصلی برای بهبود کیفیت عملکرد میکروسکوپ نوری، یافتن تعادل مناسب بین کنتراست و رزولوشن است. متأسفانه، همیشه نمی‌توان هر دو را در بهترین حالت داشت و همواره مبادله‌ای بین رزولوشن و کانتراست وجود دارد: افزایش یکی به ضرر دیگری تمام میشود. به همین دلیل روش‌های مختلفی برای بهبود کنتراست در سیستم‌های میکروسکوپی بوجود آمده است تا ضمن استفاده از بزرگنمایی زیاد و رزولوشن بالا، تصاویری با کنتراست مناسب نیز بدست آید.
کانتراست وابسته به سیستم نوردهی میدان‌گسترده:
با توجه به اهمیت سیستم نوردهی نمونه‌ها در میکروسکوپ نوری میدان‌گسترده، انواع مختلفی از میکروسکوپ‌ها طراحی شده‌اند تا کانتراست سیستم را از طریق نحوه نوردهی نمونه افزایش دهند. در ادامه به انواع مختلف این روش‌ها اشاره شده است.
-
میکروسکوپ نوری میدان‌روشن (Bright-field): در این میکروسکوپ‌ها که ساده‌ترین نوع میکروسکوپ‌های نوری هستند، نور سفید به صورت محوری به نمونه تابیده میشود و در سمت دیگر نمونه به عدسی چشمی می‌رسد. بدین ترتیب نمونه به صورت تاریک و در یک زمینه روشن، ظاهر میشود. به عبارتی افزایش کنتراست تصویر به دلیل کاهش نور منتقل شده در مناطق متراکم نمونه ایجاد میشود. میکروسکوپ میدان‌روشن برای اکثر نمونه‌های زیستی کنتراست کمی دارد، زیرا تعداد کمی از این نمونه‌ها نور را تا حد زیادی جذب می‌کنند. معمولا میکروسکوپ‌های زمینه روشن برای شناسایی جزئیات سطح و ساختار نمونه‌های میکروسکوپی که دارای رنگ ذاتی هستند و یا رنگ‌آمیزی شده‌اند، مناسب است.
-
میکروسکوپ نوری میدان‌تاریک (Dark-field): در این میکروسکوپ‌ها نور سفید توسط کندانسور به صورت یک مخروط نوری، خارج از مسیر اپتیکی شیئی و به صورت زاویه‌دار، به نمونه تابانده میشود و در نهایت فقط نور پراکنده شده از نمونه توسط شیئی جمع‌آوری میشود. ازاین‌رو افزایش کانتراست تصویر با روشن کردن نمونه توسط نوری که توسط شیئی جمع نمی‌شود و بنابراین بخشی از تصویر نیست، انجام شده و در تصویر، نمونه به صورت روشن در زمینه‌ای تاریک دیده میشود. اکثر میکروسکوپ‌های میدان‌تاریک به صورت زمینه روشن نیز قابل استفاده هستند. این نوع از میکروسکوپ‌ها برای مشاهده نمونه‌های رنگ آمیزی نشده مناسب هستند.
-
میکروسکوپ نوری پولاریزان (Polarized light): در این میکروسکوپ‌ها از نور قطبیده برای نوردهی نمونه استفاده میشود. نور به صورت محوری از نمونه عبور میکند و به سمت یک قطبشگر 90 درجه هدایت میشود. در این روش در اثر مسدود کردن نور زمینه، کانتراست تصویر افزایش می‌یابد. از این روش به طور ویژه برای نمونه‌های ناهمسانگرد و دوشکستی استفاده میشود.
-
میکروسکوپ نوری کنتراست تداخلی (Differential interference contrast (DIC)): این روش بر اساس اصل تداخل‌سنجی کار میکند و در یک سیستم نوری نسبتاً پیچیده، تصویری را تولید میکند که در یک پس زمینه خاکستری، نمونه به صورت سیاه و سفید به نظر می‌رسد. در این روش ابتدا نور قطبیده خطی شده و سپس به دو قطبش S وP شکافته میشود. این دو پرتو در مسیرهایی با اختلاف جزئی حرکت کرده و از میان نمونه عبور کرده و دوباره به هم می‌پیوندند و تفاوت مسیر نوری و پراکندگی در دو پرتو، بر اساس اصل تداخل‌سنجی، باعث افزایش کانتراست تصویر به صورت تفاوت در شدت نور و رنگ میشود.
-
میکروسکوپ نوری کنتراست فاز (Phase contrast): میکروسکوپی کنتراست فاز بر اساس تکنیک نوردهی است که شیفت فاز را در نور عبوری از یک نمونه شفاف، با تداخل بین نوری که از میان نمونه عبور میکند و نوری که مسیر بدون مانع را دنبال میکند، امکان‌پذیر میکند. به تغییرات روشنایی تصویر تبدیل میکند. شیفت فاز کمیتی نامرئی است، اما وقتی به عنوان تغییرات در روشنایی نشان داده شود، قابل مشاهده میشود. هنگامی که نور از محیط نمونه عبور میکند، برهم‌کنش با محیط باعث میشود دامنه و فاز موج، وابسته به خصوصیات محیط، تغییر کند. تغییرات دامنه (شدت نور) از پراکندگی و جذب نور ناشی میشود. تجهیزات عکاسی و چشم انسان فقط به تغییرات دامنه حساس هستند و بدون ترفندهای خاص، تغییرات فاز قابل مشاهده نیستند. با این حال، تغییرات فازی اغلب اطلاعات مهمی را منتقل می‌کنند.
در شکل زیر، تصویر ثبت شده از یک نمونه دستمال کاغذی توسط چهار نوع میکروسکوپ مختلف نشان داده شده است که به ترتیب از سمت چپ دارای سیستم نوردهی میدان‌روشن، پولاریزان، میدان‌تاریک و کنتراست فاز هستند. همانطور که مشاهده میشود استفاده از روش‌های مختلف، تفاوت کانتراست قابل ملاحظه‌ای در تصویر میکروسکوپی ایجاد میکند.
میدان دید
از نظر وسایل بینایی، میدان‌دید (Field Of View, FOV) زاویه فضایی است که حسگر نور (جمع‌کننده نور) در راس آن وجود دارد و به تابش الکترومغناطیسی که در این زاویه فضایی مشخص به آن می‌رسد، حساس است. اندازه میدان‌دید (FOV) در میکروسکوپ نوری که معادل با اندازه بخشی از نمونه ست که مشاهده میشود، به بزرگنمایی شیئی و اندازه دیافراگم چشمی، وابسته است. قطر میدان‌دید (در واحد میلی‌متر) طبق رابطه زیر تعریف میشود که (M) معرف بزرگنمایی شیئی و (FN) معرف عدد میدان است.
dfield=FN/Mobjecive
برای میکروسکوپ‌های میدان گسترده (WideField)، عدد میدان (Field Number, FN) با قطر دیافراگم در عدسی چشمی تنظیم میشود یعنی قطر ناحیه تصویر در صفحه میانی که از طریق عدسی چشمی مشاهده میشود. بنابراین مقدار عدد میدان، همانند قدرت بزرگنمایی، معمولا بر روی بدنه عدسی چشمی مشخص میشود. برای مثال عدد میدان 20 میلی‌متر نشان می‌دهد که منطقه مشاهده شده از نمونه پس از بزرگنمایی توسط عدسی شیئی به قطر 20 میلی‌متر محدود میشود. بدین معنی که اگر از یک عدسی شیئی با بزرگنمایی 40X در کنار یک چشمی با FN=20 میلی‌متر استفاده شود، در نهایت توسط این میکروسکوپ یک منطقه با قطر 500 میکرومتر را بر روی نمونه (جسم مورد بررسی) مشاهده خواهیم کرد. همانطور که مشاهده میشود، بین بزرگنمایی و اندازه میدان‌دید مبادله‌ای وجود دارد: افزایش یکی منجر به کاهش دیگری میشود. شیئی‌هایی با بزرگنمایی بیشتر، به میدان‌های دید کوچکتر نگاه می‌کنند. یک عدسی شیئی 100X (درکنار یک چشمی 10x) میدان دیدی حدود 100x100um2 را می‌بیند درحالیکه یک عدسی شیئی 10X یک میدان دید 1000x1000um2 را مشاهده میکند.