سایتومتری یا یاخته‌سنجی روشی فیزیکی برای شمارش و سنجش اجزای مختلف مجموعه‌ای از ذرات است. در روش فلوسایتومتری (Flow Cytometry) پارامترهای مختلف ذرات معلق در یک جریان مایع (به طور معمول سلولها) براساس تکنولوژی مبتنی بر اپتیک، به صورت همزمان تجزیه و تحلیل می‌شود. در این مقاله قصد داریم به توضیح مختصری در مورد نحوه عملکرد سیستم فلوسایتومتری و همچنین کاربردهای مهم این تکنولوژی بپردازیم. با ما همراه باشید.
تکنیک فلوسایتومتری
در روش فلوسایتومتری اساس کار بر پراکندگی نور و نشر طیف فلورسانس توسط ذرات است. در این روش ابتدا باید نمونه‌ای از سلول‌های مورد بررسی در مایعی به صورت یک سوسپانسیون یکنواخت قرار داده شده و رنگ‌آمیزی شود. بدین صورت که رنگ‌‌دانه‌های فلورسانت مختلفی (Fluorescent Dyes) که هرکدام به طور مشخص به یکی از اجزای اصلی نمونه متصل می‌شوند، به عنوان برچسب فلورسانسی (Fluorescent Tag) مورد استفاده قرار گیرند. پس از آماده‌سازی، نمونه سلولی از کانال‌های بسیار باریکی عبور داده شده و در مسیر حرکت از مقابل یک پرتو نوری عبور می‌کند. در برهمکنش بین پرتو نور و ذرات نمونه، بخشی از نور توسط ذرات سلولی پراکنده شده و بخشی از آن صرف برانگیختگی برچسبهای فلورسانس متصل به ذرات می‌شود. نور پراکنده شده و همچنین نور فلورسانس ساطع شده توسط آشکارساز جمع‌آوری و سپس سیگنال‌های نوری به سیگنال‌های الکتریکی تبدیل شده و مورد بررسی قرار می‌گیرد. بدین ترتیب تجهیزات فلوسایتومتری اجزای متعدد سلولی را تعیین کرده و به صورت همزمان آنها را مورد بررسی قرار میدهد. ویژگی‌هایی که توسط دستگاه فلوسایتومتری قابل اندازه‌گیری هستند عبارتند از اندازه سلول، پیچیدگی سیتوپلاسمی، محتوای DNA و RNA سلول و طیف گسترده‌ای از پروتئین‌های داخل سلولی و یا متصل به غشا.
اجزای اصلی یک فلوسایتومتر
سیستم فلویدیک
تکنولوژی فلویدیک (Fluidics) با نگهداری، کنترل دقیق و هدایت سیالاتی در حجم‌های بسیار کم سروکار دارد. یک سیستم فلویدیک متشکل از کانال‌های بسیار باریکی است که جهت جریان، رفتار و شیوه حرکت مایعات پمپ شده را تعیین و کنترل می‌کند. در روش فلوسایتومتری، این بخش مسئول هدایت سوسپانسیون نمونه سلولی از مقابل منبع نوری می‌باشد، به طوری که هر سلول در مسیر خود به صورت یک واحد جداگانه مورد ارزیابی قرار گیرد. به طور کلی در این روش سیستم فلویدیک جریانی از سوسپانسیون سلولها را به درون یک جریان حامل وارد می‌کند. مایع حامل (Sheath Fluid) سلولها را در مرکز کانال متمرکز می‌کند، بنابراین سلولها به طور منظم و در یک مسیر مجازی به نقطه اندازه‌گیری منتقل می‌شوند. این پدیده که در دستگاه فلوسایتومتر موجب ایجاد اطلاعات منحصر به فرد از یک ذره یا سلول می شود، به نام اثر هیدرودینامیک کانونی (Hydrodynamic Focusing) شناخته می‌شود. این فرایند با سرعت بالایی انجام می‌شود. حجم نمونه به طور معمول حدود ۱۰۰ میکرولیتر و یا کمتر و سرعت جریان نمونه در فلوسایتومتری ۵ تا ۵۰ متر در ثانیه ست و امکان جمع‌آوری اطلاعات ۵۰۰۰ تا ۵۰۰۰۰ سلول در هر ثانیه را فراهم می‌کند. این ویژگی فلوسایتومتری را به عنوان یک تکنیک فوق‌العاده در مطالعات کلینیکی مطرح نموده است.
سیستم اپتیکی
سیستم اپتیکی، نور را بر روی ذرات نمونه متمرکز می‌کند و همچنین پراکندگی نور یا طیف فلورسانس ساطع شده از ذرات را جمع‌آوری می‌کند و به آشکارساز می‌رساند. این سیستم به طور معمول متشکل از یک یا چند منبع نوری (لیزر و یا Arc lamp) به همراه تعدادی عدسی، فیلتر و آشکارساز می‌باشد. عدسی‌ها و فیلترها جهت متمرکز نمودن و انتقال نور منبع به نقطه اندازه‌گیری و نیز برای جمع‌آوری و هدایت سیگنال‌های نور پراکنده شده و نور فلورسانس ساطع شده از نقطه اندازه‌گیری به آشکارسازها به کار می‌روند. در فلوسایتومتری معمولا از لیزر به عنوان منبع نوی استفاده می‌شود. مزایای استفاده از نور تکفام و با سطح مقطع بسیار کوچک در منابع نوری لیزری نسبت به سایر لامپ‌ها بسیار با اهمیت است. هرچه نور متمرکزتر بوده و در فضای کوچک‌تری محدود شود، میزان پراکندگی و یا برانگیختگی ذره و یا ماده فلورسانس متصل به ذره بیشتر خواهد بود. همچنین متمرکز بودن پرتوی نور سبب اطمینان از تابش نور به تنها یک ذره در هر لحظه خواهد شد. پس از برهمکنش نور با جریان سلولی، پراکندگی نور در دو جهت مختلف اندازه‌گیری می‌شود، جهت رو به جلو (Forward Scatter یا FSC) که می تواند اندازه نسبی ذرات را مشخص کند و در جهت عمود یا 90 درجه (Side Scatter یا SSC) که پیچیدگی داخلی سلول را نشان میدهد. برای اندازه‌گیری طیف‌های پراکندگی در دو جهت، آشکارسازهای مجزا تعبیه می‌شود. بدین ترتیب پراکندگی نور در زوایای مختلف می‌تواند سلولها را براساس تفاوت در اندازه و پیچیدگی‌های درونی از هم متمایز کند؛ در حالی‌که نور فلورسانس تابش شده از سلولها می‌تواند نوع سلول را متمایز کند (پراکندگی نور مستقل از فلورسانس است). یکی از ویژگی‌های اصلی یک دستگاه فلوسایتومتر تعداد کانال‌های فلورسانسی است که بیانگر تعداد طیف‌های فلورسانس متمایزی است که از برچسبهای مختلف به طور همزمان قابل آشکارسازی باشند. در دستگاه‌های فلوسایتومتری برای شناسایی چندین سیگنال فلورسانس به طور همزمان، انتخاب نوع و آرایش و محل قرارگرفتن فیلترهای نوری یکی از مسائل بسیار بااهمیت می‌باشد. در تصویر پایین سمت چپ، سیستم فلویدیک و سیستم اپتیکی یک فلوسایتومتر را مشاهده می‌کنید. سیگنال‌های فلورسانس مربوط به برچسبهای متمایز توسط فیلترهای مرتبط به سمت آشکارهای مجزا هدایت و آشکارسازی می‌شود به گونه‌ای که هم‌پوشانی طیفی تا حدامکان از بین برود. امروزه در دستگاه‌های فلوسایتومتری تا چندین لیزر و فیلترهای نوری مختلف برای برانگیخته کردن برچسبهای فلورسانس گوناگون و سپس جداسازی طیف‌های مربوطه استفاده می‌شود. در میان انواع لیزرها، لیزر آبی آرگون با طول موج ۴۸۸ نانومتر و لیزر قرمز هلیوم-نئون با طول موج ۶۳۵ نانومتر بیشترین استفاده را دارند.
سیستم الکترونیک
یک سیستم الکترونیک در تکنولوژی فلوسایتومتری شامل مبدل‌های سیگنال نوری به سیگنال الکتریکی قابل پردازش می‌باشد. هنگامی که سیگنال نوری جمع‌آوری شده توسط آشکارسازها به سیگنال الکتریکی تبدیل شد، بر اساس قالبی استاندارد به نام استاندارد فلوسایتومتری (FCS) این اطلاعات ذخیره می‌شوند. سپس با استفاده از نرم افزارهای مناسب پردازش اطلاعات، برای انجام محاسبات ریاضی و آماری و همچنین ترسیم نمودارهای یک، دو یا سه بعدی به کار برده می‌شوند. هر دستگاه فلوسایتومتری نرم افزار خاصی را برای دریافت، نمایش و آنالیز داده‌ها بر روی کامپیوتر دستگاه خود دارا می‌باشد. داده‌های دستگاه فلوسایتومتری معمولاً به صورت نمودار و گراف نمایش داده می‌شوند. انواع مختلفی از نمودارها در فلوسایتومتری وجود دارند که همه بیانگر نمایش کمی یک شاخص می‌باشند. در تصویر پایین سمت راست، شماتیکی از سیستم الکترونیکی و مثالی از یک نمودار خروجی فلوسایتومتری نشان داده شده است.
آماده‌سازی سوسپانسیون و برچسبهای فلورسنت
روش‌های آماده‌سازی سوسپانسیون نمونه بسته به نوع سلول مورد ارزیابی متفاوت است. هنگام تهیه سوسپانسیون مناسب، سلولها به طور مستقیم با فلوروکروم‌ها و یا آنتی‌بادی‌های متصل به فلوروکروم نشاندار می‌شوند. میزان اختصاصی بودن آنتی‌بادی، مناسب بودن غلظت آنتی‌بادی مورد استفاده، غلظت آنتی‌ژن در سطح یا داخل سلول و به کار بردن کنترل‌های مثبت و منفی مناسب در آنالیز سلولها، عواملی است که نشاندار کردن سلولها را تحت تاثیر قرار می دهد. حداقل حجم مورد نیاز از نمونه به مقدار سلول‌های مورد نظر در میان انواع سلول‌های موجود در نمونه نیز بستگی دارد و اگر درصد سلول‌های مورد بررسی، نسبت به سایر سلول‌های موجود پایین باشد لازم است ابتدا بخشی از سلول‌های نامطلوب حذف شود. قطر سلول‌های مورد ارزیابی معمولا در محدوده ۱ تا ۳۰ میکرون است و فلوسایتومترهای معمولی برای ارزیابی ذرات کوچکتر از ۱ میکرون حساسیت لازم را ندارند. اما امروزه مجموعه‌ای از فن‌آوری‌های گوناگون و نوینی برای مطالعه سلولها و بررسی ساختار و محتوای آنها بکار گرفته شده است که حتی ذرات کوچکتر از ۰٫۱ میکرومتری نیز می‌تواند قابل تشخیص باشد. دستگاه‌های فلوسایتومتری اولیه قادر بودند فقط یک یا دو رنگ فلورسانس را تجزیه و تحلیل کنند اما امروز دستگاه‌هایی به صورت تجاری عرضه شده‌اند که قادرند تا پانزده رنگ فلورسانس (15 کانال) را به‌طور همزمان ردیابی و تجزیه و تحلیل کنند. بنابراین استفاده از تعداد متعددی برچسب فلورسانسی برای شناسایی تعداد بیشتری از اجزای نمونه را امکان پذیر کرده‌اند. برچسبهای فلورسنت مورد استفاده در فلوسایتومتری طی سالیان متمادی در حال افزایش بوده است. امروزه انوع مختلفی از برچسب‌ها برای رنگ‌آمیزی سلولها و اجزای داخلی آنها مورد استفاده قرار می‌گیرند. در جدول زیر لیستی از پرکاربردترین برچسبهای فلورسنت مورد استفاده در تکنیک فلوسایتومتری را مشاهده می‌نمایید. رایج‌ترین برچسب‌هایی که در فلوسایتومتری استفاده می‌شوند، Fluorescein Isothiocyanate) FITC) و Phycoerythrin) PE) می‌باشند. این برچسب‌ها در محدوده 488 نانومتر طیف‌های جذبی دارند. بنابراین یک طول موج تحریکی لیزری، می‌تواند این دو رنگ را همزمان تحریک کند درحالی‌که طیف تابشی متفاوتی دارند و در کانال‌های متفاوتی می‌توانند مورد بررسی قرار بگیرند.
